Aktiivisessa kohdassa entsyymin kemialliset ryhmät muodostavat sopivia sidoksia substraattiin, mikä saa substraatin sitoutumaan aktiiviseen kohtaan. Kun substraatti sitoutuu aktiivisen kohtaan, entsyymin muoto muuttuu. Tämä saa aikaan muutoksen myös substraatissa, mikä helpottaa kemiallista reaktiota.

Osa entsyymeistä osallistuu kemialliseen reaktioon muodostamalla kovalenttisia sidoksia substraatin kanssa. Esimerkiksi mahalaukussa muita proteiineja hajottava pepsiini sitoutuu lyhytaikaisesti substraattiinsa eli toisiin proteiineihin. Näin se katkaisee proteiinista kahden aminohapon välisen peptidisidoksen. Kun entsyymi on suorittanut tehtävänsä, se irtoaa substraatista. Tämän jälkeen se on valmis katalysoimaan uutta reaktiota.

Entsyymi-inhibitiota on kahdentyyppisiä: palautuvaa ja ei-palautuvaa. Ei-palautuvassa inhibitiossa inhibiittori sitoutuu entsyymiin kovalenttisesti ja estää sen toiminnan. Entsyymi ei siis palaudu enää toimintakykyiseksi vaan se täytyy hajottaa. Monet lääkeaineet, kuten penisilliini ovat tällaisia inhibiittoreita.

Palautuvassa inhibitiossa inhibiittori sitoutuu entsyymiin heikoin sidoksin. Inhibiittori voi matkia substraattia ja sitoutua entsyymin aktiiviseen kohtaan. Tällaista inhibitiota kutsutaan kilpailevaksi eli kompetitiiviseksi inhibitioksi.

Inhibiittori voi sitoutua myös muuhun kohtaan entsyymiä: tällöin entsyymin muoto voi muuttua ja se ei enää kykene sitomaan substraattia aktiiviseen kohtaan. Tällaista estoa kutsutaan ei-kilpalevaksi estoksi. Jotkin inhibiittorit voivat olla sekä kilpailevia että ei-kilpailevia samanaikaisesti.